Un microscopio de fluorescencia no es más que es un microscopio óptico convencional al que se le adapta un accesorio complementario de iluminación, denominado "fluorescencia". En Bioindicación te hablaremos de este accesorio de fluorescencia que utiliza los mismos objetivos de aumento para formar la imagen. Con este accesorio incorporado podremos realizar una observación óptica convencional y además una observación de contraste con fluorescencia.

 

 

El accesorio de fluorescencia se puede incorporar en el momento de la compra del equipo o con posterioridad. Este es un aspecto importante en el momento de hacer la inversión en la compra de un microscopio porque el fabricante puede cambiar con más o menos asiduidad el catálogo de modelos y cuando queramos adaptar en el futuro el sistema de fluorescencia no sea posible por ser un equipo obsoleto, o bien porque el modelo adquirido no disponga de la posibilidad de adaptación.

 

Deberá tener en cuenta otras consideraciones necesarias a la hora de adaptar un sistema de fluorescencia a su microscopio, como el tipo de óptica (objetivos previstos), tipo de diseño óptico (corrección a infinito, longitud finita, etc.). Consúltenos para informarle según su caso.

 

 

La fluorescencia acoplada a un microscopio “tradicional” se le denomina “epifluorescencia” porque se inserta por encima del sistema óptico (objetivos de aumento), trabajando por reflexión lumínica como veremos a continuación.

 

 

 

 

El microscopio óptico necesariamente debe tener alguna característica especial para que sea nuestro perfecto aliado en nuestro trabajo de bioindicación con fluorescencia. Hablaremos de objetivos que tengan una buena transmisión lumínica (los fabricantes diseñan objetivos con lentes de “fluorita” con mayor transmisión lumínica para estos efectos, aunque son sensiblemente más caros que los convencionales) y una buena definición (Apertura Numérica), aunque esto último no es imprescindible para configurarse como un microscopio de fluorescencia para rutina diagnóstica.

 

Así pues, el accesorio de fluorescencia es un sistema de iluminación complementario, con un funcionamiento similar al del microscopio óptico convencional pero con unas particularidades que lo hacen diferente.

 

 

La epifluorescencia consta de un una fuente de alimentación eléctrica, un portalámparas que incluye una lámpara de vapor de mercurio (mejor que una lámpara halógena o de tipo led), un sistema colector de luz y unos filtros de fluorescencia específicos.

 

 

 

 

La fuente de alimentación incluye un transformador independiente que alimenta la lámpara e incluye un contador horario para controlar las horas de funcionamiento de la lámpara, ya que éstas tienen una vida corta y sus particularidades de emisión disminuyen con el paso del tiempo (habitualmente los  fabricantes recomiendan hacer la substitución de la lámpara cada 200-300 horas de trabajo, según modelo y fabricante).

 

El portalámparas, que alberga la lámpara de vapor de mercurio, debe estar bien ventilado (estas lámparas desprenden mucho calor), con protección térmica de seguridad para evitar quemaduras por descuidos e incluir un sistema de centrado de la lámpara en los tres ejes. Al iluminar una zona muy pequeña (microscópica) deberemos poder concentrar bien la luz emitida sobre nuestra muestra y lo conseguiremos centrando la lámpara con el eje óptico (eje Y) y con la muestra enfocada (eje X). El tercer eje “Z” nos permite desplazar ligeramente la lámpara hacia un lado, evitando que el reflejo de luz del espejo de reflexión que existe en el portalámparas coincida con la propia lámpara, evitando el sobrecalentamiento de la misma.

 

 

 

 

La lámpara de vapor de mercurio, de alta presión, genera un arco eléctrico incandescente en los polos positivo/negativo dónde se concentran las moléculas gaseosas de mercurio, emitiendo una luz blanca muy intensa que concentraremos sobre la muestra.

 

La luz generada se canaliza por el sistema colector de luz, permitiendo centrar y seleccionar el haz  de luz hasta los filtros.

 

 

Así como el sistema de iluminación convencional del microscopio nos permite ver la muestra por transmisión (la luz atraviesa la muestra, se recoge en el objetivo formando la imagen y se aumenta en el ocular para enfocarla y hacerla visible), en el microscopio de fluorescencia la muestra la vemos por reflexión de la luz. En este caso la luz se transmite desde la lámpara de vapor de mercurio mediante el sistema colector de luz hasta el objetivo de aumento que ayuda a su vez a concentrar la luz sobre la muestra y ésta se refleja nuevamente con una longitud de onda mayor pero de menor energía.

 

Es la ley de física óptica de Stokes. Cuando iluminamos un objeto con luz blanca el color con el que lo vemos corresponde al color que más refleja: un objeto de color verde absorbe todas las longitudes de onda y refleja la verde. Un objeto de color negro absorbe todas las longitudes de onda y uno de color blanco las refleja todas.

 

 

En diagnóstico FISH (Fluorescence In Situ Hibridation) se utilizan moléculas que incorporan un determinado fluoróforo o fluorocromo (“colorante”) con el fin de que cuando se ilumina con una fuente de luz podamos verlo con un color determinado. A nivel molecular la cantidad de luz percibida es muy pobre y si iluminamos con luz blanca una molécula de color no podremos distinguirla. Para ello se utilizan filtros específicos para seleccionar e iluminar únicamente la muestra con una zona determinada del espectro visible. A estos filtros se les denomina filtros de excitación.

 

 

 

 

Por ejemplo un fluorocromo ampliamente utilizado en la técnica FISH es la fluoresceína (FITC). Esta molécula al serexcitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente de 495 nm (azul) emite una luz en color verde visible cuya longitud de onda es mayor (de alrededor de 519 nm), pero de menor energía. Para ver este fluorocromo en un microscopio de fluorescencia, por un lado utilizaremos filtros que acoten la longitud de onda azul de iluminación o filtros de excitación y por otro lado utilizaremos filtros de barrera (emisión) que me permitirán ver la fluoresceína en color verde y no el resto de colores, consiguiendo acotar las longitudes de onda necesarias de forma que no se interfiera la observación. Entre medio de estos dos filtros se intercala el espejo dicroico que refleja ciertas longitudes de onda y deja pasar (actúa como si fuera trasparente) longitudes de onda mayores. Este espejo dicroico es básico para seleccionar ópticamente un intervalo correcto de longitudes de onda.

 

El fabricante monta estas tres piezas (filtros de excitación, filtros de barrera y espejo dicroico) en forma de cubo, desplazable respecto al eje óptico para poderlo intercalar en el paso óptico en el momento de la observación, según queramos hacer una observación microscópica convencional  o bien una observación con fluorescencia.

 

Cuanto más selectivos sean estos filtros mejor contraste de imagen tendremos en el microscopio, el fondo será más oscuro y la fluorescencia más brillante y contrastada.

 

 

 

 

El sistema de detección y cuantificación genética microbiana VIT® de Vermicon, se basa en la ténica de contraste FISH y requiere de un microscopio de fluorescencia para realizar la lectura y la cuantificación del test.

 

También Microplanet® puede asesorarle en el uso y suministro de microscopios rutinarios para el análisis de bioindicación convencional, en el de microscopios de fluorescencia debidamente equipados para la analítica VIT® (también como equipo de rutina en EDAR), o en equipos para departamentos de I+D donde se requieren características diferentes a las de rutina.

 

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