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No profanar el sueño de las ESPUMAS: la maldición del misterio de Milwaukee

09/11/2021

No profanar el sueño de las ESPUMAS: la maldición del misterio de Milwaukee

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Andrés Zornoza Zornoza

Andrés Zornoza Zornoza

  • Científico freelance
  • Director Área H2O en WALEBUBLÉ y H2OCITIES
  • Doctor en Ingeniería del Agua y Medioambiental (UPV)
  • Fundador de www.walebuble.com
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"Desde mi punto de vista, para poder llegar a esclarecer el misterio de Milwaukee, los investigadores tendremos que centrar nuestros esfuerzos en los estudios temporales y espaciales (diferentes EDAR) de las actividades exoenzimáticas, combinándolo con análisis fisicoqúimicos de ciertos compuestos del flóculo"
 
Sucedió en febrero de 1969, en la planta de tratamiento de aguas residuales de Jones Island, en la localidad de Milwaukee (Wisconsin, USA). Como si fueran aquellos caminantes de 1974 saliendo de sus tumbas con hambre y sed de venganza, en la película dirigida por Jorge Grau “No profanar el sueño de los muertos”, una masa flotante y grasienta de sólidos y microorganismos levitaba sin control de los reactores biológicos de la instalación, bajo la mirada atónita de los que allí se encontraban, entre ellos, una persona anónima que pudo documentar lo que aquel día ocurrió, y del que nada se volvió a saber jamás (Anonymus, 1969).
 
Este asombroso suceso fue llamado “El misterio de Milwaukee”, y fue la primera vez que se observó la formación de espumas biológicas, conteniendo gran cantidad de microorganismos actinomicetos ramificados Gram positivos. Posteriormente, estas bacterias fueron identificadas como pertenecientes al género Nocardia y, por ello, a estas espumas se las empezó a conocer como “Nocardia foams”. Inmediatamente, después del suceso de Milwaukee, las medidas de control operacional y la mayoría de intentos para sofocar la ira de las espumas fracasaban sin explicación alguna.
 
Después de casi medio siglo, y aunque hayamos podido avanzar en el conocimiento taxonómico de aquellos “seres”, en su ecofisiología, así como en mejorar los diseños de los sistemas de decantación secundarios, todavía no hemos conseguido dar una explicación científica al misterio de Milwaukee, siendo miles de estaciones depuradoras afectadas en todo el mundo, por estos seres ramificados, como si de una maldición se tratara.
 
 
 
Nocardioformes
 
 
Con el presente artículo mostraré al lector curioso, al apasionado de la microbiología, al estudiante, así como a los técnicos de las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) que sufren periodos de pánico, los conocimientos de una de las bacterias ramificadas formadoras de espumas (foaming) más “feroces” de los fangos activos, envuelta en el misterio de Milwaukee: Gordonia amarae like-organisms (GALO). Para ello, lo ilustraré con tres sencillas preguntas: ¿Quiénes?, ¿Cómo? y ¿Por qué?, evitando en la medida de lo posible el riguroso texto científico.
 
¡Damos paso a conocer algunos de los secretos del misterio de Milwaukee!
 


¿Quiénes?

 
Tal cual he señalado anteriormente, la primera vez que se documentó un episodio de foaming causado por bacterias Gram positivas fue en 1969, durante el misterio de Milwaukee. Inmediatamente después de este suceso, los microbiólogos centraron sus esfuerzos en intentar dilucidar quienes eran las especies responsables, siendo en 1974 cuando fueron atribuidas a miembros del género Nocardia, concretamente Nocardia amarae y Nocardia rhodochrous y, por ello, denominadas “Nocardia Foams”. De ahí, viene el término incorrecto “Nocardia”, que todavía muchos técnicos de explotación de EDAR emplean cuando aparecen episodios de espumación o foaming en sus plantas. ¿Por qué es incorrecto emplear el término “Nocardia”?. Detallemos a continuación los motivos.
 
  • Por un lado, se ha demostrado y se piensa que existen otros organismos capaces de formar espumas biológicas.
 
  • Por otro lado, los estudios de bacterias del grupo Mycolata, han conducido a grandes cambios en su clasificación, entre ellos, se incluye la transferencia de Nocardia rhodochrous al género Rhodococcus. La conocida formadora de foaming Nocardia amarae, fue reclasificada en 1994 como Gordona amarae, y posteriormente nombrada en 1997 como Gordonia (nombre etimológicamente más correcto).
 
Conozcamos algo más sobre el grupo Mycolata. La mayoría de microrganismos filamentosos observados en episodios de espumación son, además de Ca. ‘Microthrix parvicella’, miembros del grupo Mycolata: actinomicetos que contienen ácidos micólicos en sus paredes celulares.
 
El grupo Mycolata se encuentra dentro del suborden Corynebacterineae, dentro de la clase Actinobacteria, y engloba especies bacterianas caracterizadas por presentar filamentos ramificados, actualmente clasificados en 13 géneros: 
 
  • Corynebacterium
  • Dietzia
  • Gordonia
  • Millisia
  • Mycobacterium
  • Nocardia
  • Rhodococcus
  • Segniliparus
  • Skermania, 
  • Smaragdicoccus
  • Tomitella
  • Tsukamurella
  • Williamsia
 
Para facilitar la identificación rutinaria de estas bacterias filamentosas en las EDAR, fueron propuestos dos morfotipos, los cuales se pueden diferenciar fácilmente a partir de la microscopía convencional, empleada por los técnicos de EDAR en su análisis rutinario. El primero, el cual comparten varios géneros del grupo Mycolata, muestra filamentos ramificados aproximadamente en ángulo recto. Esta morfología fue inicialmente propuesta en 1974 en la descripción de Gordonia amarae, denominando finalmente a los organismos con morfología similar como Gordonia amarae-like organisms (GALOs). De ahí proviene el término “tipo GALO”, que empleamos cuando observamos filamentos cortos ramificados, en 90º aproximadamente, de 1 µm de diámetro celular y Gram positivos.
 
 
 
Gordonia amarae like-organisms
 
 
El segundo, que muestra un patrón de distribución de ramificaciones en ángulo agudo, tal cual fue descrito en 1997 para Skermania piniformis, fue originalmente denominado en 1989 como “pine tree-like organisms” (PTLOs), por su morfología similar a “ramas de árbol”. Actualmente a este morfotipo lo denominamos como “tipo PTLO” o “tipo Skermania”, con la forma característica señalada, ramificaciones de mayor longitud que GALO, de 1 µm de diámetro celular y Gram positivos.
 
 
 
Pine tree like-organisms (PTLO, Skermania)
 
 
Actualmente, es posible identificar ambos morfotipos a través de la técnica de hibridación in situ con sondas 16S/23S rRNA marcadas con fluoróforos (FISH), empleando las siguientes sondas moleculares: Gor0596 (específica de GALO/Gordonia sp.) y Spin1449 (específica de PTLO/Skermania piniformis).
 


¿Cómo?

 
Inmediatamente después del suceso de Milwaukee, fueron numerosos los científicos que se cuestionaron cómo era posible que dichas espumas tuvieran tanta estabilidad y fuera tan difícil llegar a eliminarlas de los reactores biológicos. A partir de entonces,i algunos estudios se centraron en la búsqueda de los mecanismos de la formación del foaming.
 
Pipes en 1978 fue quien propuso la primera teoría, en la cual señala que la morfología ramificada de las bacterias nocardioformes se dispone formando una “red” entre los flóculos, atrapando gotas de aceites y grasas y burbujas de gas, originando que el fango flote a la superficie. Posteriormente, Soddell & Seviour (1990) proponen que el alto contenido lipídico de las células de Candidatus ‘M. parvicella’ y bacterias pertenecientes al grupo Mycolata, conducen a una menor densidad, originando que tanto las grasas como el fango floten.
 
Otras teorías indican que los organismos que causan foaming se enriquecen de forma selectiva en la espuma. Sin duda alguna, en lo que sí que coinciden la mayoría de investigadores es que la estabilidad de la espuma en fangos activos se encuentra favorecida por la hidrofobicidad que confieren los filamentos a las partículas sólidas. Dichos filamentos poseen una superficie hidrofóbica celular, originando una espuma que consiste en tres fases. Estas partículas deben ser de pequeño tamaño (menos de 300 µm) para que puedan ser elevadas por flotación a través de las burbujas de aire del sistema de aireación. Las partículas hidrofóbicas también pueden crear puentes entre dos burbujas de aire. Por lo tanto, para la formación de una espuma estable, son varios los factores que deben estar presentes: burbujas de gas, partículas hidrofóbicas y surfactantes de origen biológico (biosurfactantes).
 
 
 
Formación de espuma estable en el reactor biológico
 
 
El análisis microscópico de espumas de fangos activos muestra que el foaming consiste en burbujas de aire sujetas en una densa matriz de microorganismos filamentosos, en cuyo alrededor se encuentran burbujas individuales que contienen material celular. La formación de burbujas se ve favorecida por los sistemas de agitación del reactor biológico, siendo mayor la capa emulsionada cuanto mayor es la agitación mecánica y el caudal de aire aplicado.
 
Un tensoactivo es una sustancia que, cuando se presenta en bajas concentraciones en un sistema, tiene la propiedad de reducir la tensión superficial del agua. Los agentes tensoactivos también están presentes en el sistema biológico, ya que los organismos relacionados con dichos episodios pueden producir biosurfactantes. La participación de las células y biosurfactantes extracelulares en la formación y estabilización del foaming fue demostrada en el cultivo de Gordonia amarae SC1. Por todo ello, el licor mezcla procedente de plantas con problemas de foaming muestra menor tensión superficial que el del resto de plantas sin espumas, sugiriendo que grandes cantidades de tensoactivos se encuentran presentes en las plantas con foaming.
 
 
 
Biosurfactante (burbuja de aire "atrapada")
 
 

¿Por qué?

 
Serán muchos los responsables de EDAR que estarán esperando con anhelo esta última parte del post, con el fin de buscar una explicación a sus problemas en planta originados por GALO, un rayo de esperanza para no sufrir más periodos de pánico. La mala noticia es la siguiente: no es posible responder a la pregunta ¿por qué?, es decir, los resultados científicos actuales no son lo suficientemente concluyentes como para explicar la dinámica poblacional espacial y temporal de Gordonia amarae like-organisms (GALO) en plantas depuradoras a escala real.
 
Sin duda, los mayores esfuerzos en la investigación de bacterias formadoras de espumas del grupo Mycolata han ido encaminados a resolver su filogenia, describir los mecanismos de formación de la espuma, así como al estudio de estrategias no específicas para combatir los episodios de espumación, siendo los estudios de ecología escasos y mal planteados. Algunos autores señalan la falta de comprensión de los factores fisicoquímicos y biológicos que desencadenan los episodios de foaming, no encontrándose todavía variables operacionales y fisicoquímicas del agua residual, así como criterios de diseño, desencadenantes de dichos episodios.
 


Un amante del buffet libre

 
Desde el suceso de Milwaukee, el estudio de la dinámica poblacional del grupo Mycolata en fangos activos ha estado marcada por las discrepancias entre los distintos investigadores. De forma común, elevadas concentraciones de aceites y grasas en el afluente a las EDAR han sido sugeridas como posibles causas en el desarrollo de microorganismos del grupo Mycolata. Además, algunos autores han asociado elevadas concentraciones de grasas con episodios de foaming, mientras que la habilidad de las bacterias formadoras de espumas de consumir sustratos hidrofóbicos ha sido demostrada en laboratorio y en estudios de modelización. De forma específica, Gordonia amarae es capaz de crecer bien a partir de sustratos hidrofóbicos, como son: aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de coco, Tween 80 y trioleato como única fuente de carbono, debido probablemente a que su pared celular es altamente hidrofóbica. Contrariamente, también se ha demostrado que Gordonia amarae no crece con ácido oleico y palmítico como única fuente de carbono después de dos semanas.
 
Además, estos resultados han podido ser corroborados a partir de estudios de ecofisiología in situ, indicando que el ácido oleico parece no ser asimilado en presencia de otros sustratos, así como el ácido palmítico (Kragelund et al., 2007). Contrariamente, los resultados de otros estudios indican que Gordonia amarae es capaz de asimilar ácido palmítico, sugiriendo que podría mostrar una elevada selectividad por dicho sustrato en las espumas del fango activo. Como puede apreciar el lector, existen discrepancias entre los resultados de los diferentes investigadores, y es que otros autores han incluido las bacterias Gram positivas (Mycolata) dentro del grupo “formadores de espumas versátiles” (Nielsen et al. 2009), debido al amplio espectro de sustratos capaces de ser asimilados por las bacterias pertenecientes a este grupo (Kragelund et al., 2007), lo cual parece explicar la codominancia observada con Ca. ‘Microthrix parvicella’ en fangos activos, así como dichas discrepancias. Por todo ello, GALO parece no depender exclusivamente de la elevada concentración de aceites y grasas en el afluente, sino que es capaz de utilizar una amplia gama de sustratos orgánicos, como si en un “buffet” se encontrara.
 


La dependencia del oxígeno: un bulo envuelto en contradicciones

 
De forma muy común se ha señalado que el grupo Mycolata lo forman organismos obligatoriamente aerobios y, por esta razón, muchos responsables de planta optan por “afixiar” los reactores biológicos, dejándolos sin oxígeno durante la entrada del agua residual sin tratar, provocando mayores desastres.
 
Los resultados de los estudios de ecofisiología in situ parecen contradecir dicha afirmación, puesto que en algunos de ellos la asimilación del sustrato ha sido también observado bajo condiciones anóxicas y anaerobias, utilizando nitrato y nitrito (menor asimilación) como aceptores terminales de electrones. Teniendo en cuenta lo indicado sobre el oxígeno disuelto, parece lógico que algunos autores no hayan encontrado una relación significativa entre dicha variable y Gordonia sp.
 


La carga másica (CM): una variable no suficientemente contrastada

 
Los resultados sobre la importancia de dicha variable han sido contradictorios en numerosos trabajos, probablemente al no considerar la influencia del tiempo de retención hidráulico en los reactores biológicos (Zornoza, 2017). En este sentido, algunos trabajos han concluido que los episodios de foaming se originaron cuando la CM se encontraba en el intervalo de 0,1-0,2 Kg DBO5/Kg SSLM.d, mientras que otros indican que descensos seguidos de incrementos en la CM por debajo de 0,2 Kg DBO5/Kg SSLM.d y concentración de la DBO5 del afluente primario fueron los factores determinantes en el crecimiento inicial de Gordonia amarae.
 
Por otro lado, la población de bacterias nocardioformes ha sido asociada a un intervalo de CM muy amplio, según algunos manuales de identificación convencional (0,1-0,7 Kg DBO5/Kg SSLM.d), al considerar probablemente las bacterias GALO y tipo Skermania como un solo grupo (nocardioformes), mientras que otras han sido asociadas cuando la CM se mantuvo por debajo de 0,5 Kg DBO5/Kg SSLM.d. Contrariamente, otros investigadores han encontrado, a partir del análisis multivariante, que la CM no fue una variable significativa durante los episodios de foaming. No cabe duda, que si algo tiene la CM es que se trata de una variable muy poco útil para la explotación de las EDAR.
 


La temperatura en el reactor (Tªr): una variable no determinante

 
Es bastante frecuente escuchar en el sector de la depuración, la siguiente frase: “…Microthrix en invierno y Nocardia en verano…”. Pues bien, a partir de las conclusiones de los trabajos científicos realizados hasta el momento, podemos afirmar que no es cierto que GALO siga un patrón estacional, siendo dicha afirmación totalmente errónea, en lo que a estos organismos se refiere.
 
El papel de la temperatura en la ocurrencia de los episodios de foaming se encuentra bien documentada. En este sentido, algunos autores han señalado que existe una elevada frecuencia de dichos episodios en climas templados, sugiriendo que dichas observaciones son debidas al elevado mínimo (10-15 ºC) y al óptimo (28 ºC) de temperatura de crecimiento de GALO.
 
Teniendo en cuenta el amplio rango de temperatura para su crecimiento, la Tªr probablemente no parece ser una variable determinante en la formación de espumas, estando de acuerdo con lo señalado por algunos autores. Otros han sugerido que el aumento de la Tªr incrementa sustancialmente la hidrólisis de compuestos de origen lipídico y, por lo tanto, ante un incremento de la carga de dichos compuestos, se desencadenan episodios de foaming causados por Gordonia sp. y bacterias del grupo Mycolata. Dicho mecanismo propuesto, documentado a partir de un estudio en una EDAR durante 8 años, no ha sido corroborado ni demostrado en posteriores trabajos sobre incidencia de episodios de foaming.
 


Las actividades exoenzimáticas: armas potentes subestimadas

 
GALO es una bacteria filamentosa “pequeña”, “silenciosa” y muy “rápida”, características que la hacen “letal” para la “salud” de nuestros biorreactores. Las cortas ramificaciones características de GALO la hacen muy competitiva en el interior del flóculo, desarrollándose rápidamente dentro del mismo, pudiendo pasar desapercibidas en las primeras fases de su crecimiento, si no se práctica una tinción de Gram. Por esta razón, siempre nos “pillarán” desprevenidos, y es que no cabe duda que si algún “arma potente” tiene este dichoso organismo, es: la actividad exoenzimática, es decir, tiene la capacidad de liberar enzimas en el entorno más cercano a la membrana celular, con el fin de utilizar sustratos (compuestos orgánicos y nutrientes limitantes) específicos que la harán muy competitiva en el medio, en este caso, en el interior del flóculo.
 
Algunos investigadores han encontrado elevada actividad fosfatasa y glucuronidasa (Zornoza et al., 2013), mientras que otros han demostrado, además, actividades esterasa y lipasa (Kragelund et al., 2007). Por todo ello, estos organismos tienen una elevada viabilidad y son capaces de sobrevivir en las espumas biológicas largos periodos de tiempo, siendo esta la razón por la cual los episodios de foaming afectan durante largos periodos de tiempo, si no centramos los esfuerzos en retirar mecánicamente las natas emulsionadas.
 
 
 
Actividad fosfatasa (GALO, tinción neisser)
 
 

Conclusiones

 
Desde mi punto de vista, para poder llegar a esclarecer el misterio de Milwaukee, los investigadores tendremos que centrar nuestros esfuerzos en los estudios temporales y espaciales (diferentes EDAR) de las actividades exoenzimáticas, combinándolo con análisis fisicoqúimicos de ciertos compuestos del flóculo.
 
Además, es necesario el estudio multivariante a gran escala, de estaciones depuradoras que relacionen la presencia de GALO con diferentes factores ambientales, con el fin de encontrar aquellos patrones que desencadenan su crecimiento. Hasta que llegue ese momento, la maldición del misterio de Milwaukee continuará…
 
 
 
*Este post está dedicado a la memoria del Dr. Gonzalo Cuesta Amat, amante del estudio de bacterias del grupo Mycolata.
 
 
Referencias
 
  • Anonymous (1969) Milwaukee mystery: unusual operating problem develops. Water Sewage Works 116: 213.
  • Pipes, W.O. (1978) Actinomycete scum production in activated sludge processes. Journal of the Water Pollution Control Federation Abril: 628-634.
  • Kragelund, C., Remesova, Z., Nielsen, J.L., Thomsen, T.R., Eales, K., Seviour, R. et al. (2007b) Ecophysiology of mycolic acid-containing Actinobacteria (Mycolota) in activated sludge foams. FEMS Microbiology Ecology 61: 174-184.
  • Nielsen, P.H., Kragelund, C., Seviour, R.J., y Nielsen, J.L. (2009a) Identity and ecophysiology of filamentous bacteria in activated sludge. FEMS Microbiology Reviews 33(6): 969-998.
  • Soddell, J.A., y Seviour, R.J. (1990) A review: microbiology of foaming in activated sludge plants. Journal of Applied Bacteriology 69: 145-176.
  • Nielsen, P.H., Kragelund, C., Seviour, R.J., y Nielsen, J.L. (2009a) Identity and ecophysiology of filamentous bacteria in activated sludge. FEMS Microbiology Reviews 33(6): 969-998.
  • Zornoza, A. Gil, P., Amorós, I., y Alonso, J.L (2013) Efecto de las variables operacionales del proceso de fangos activos en la actividad exoenzimática del grupo Mycolata en IX Jornadas Técnicas de Transferencia de Tecnología sobre Microbiología del Fango Activo. Sevilla, Spain: Grupo Bioindicación de Sevilla.
  • Zornoza, A. (2017) Estudio de la dinámica poblacional de protistas, metazoos y bacterias filamentosas y su interpretación ecológica en fangos activos. Tesis. Valencia: Universitat Politècnica de València.
 
 
Andrés Zornoza Zornoza
 
 
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